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致弱法:一种寻找“植物癌症”克星的新方法(中)
——第十九届全国青少年科技创新大赛一等奖作品
作者:谢鑫淼    文章来源:创新研究院网站    点击数:    更新时间:2008-12-11

 

编者按:本项目曾获第十九届(2004)全国青少年科技创新大赛微生物学类一等奖。

 

2.1 利用番茄组培苗检测致弱作用

2.1.1 材料与方法

在无菌条件下,分别接青枯菌强致病力菌株F.1.3-02062625 mLSPA液体培养基,接BS-100725 mL芽孢杆菌发酵培养基中,30 ,转速为200 rpm的摇床上培养,培养48 h后取出。将5 mLBS-1007菌液与5 mL的青枯菌菌液混合,于30 温箱内静置48 h后取出。分别将青枯菌菌液与混合菌液回接30株番茄组培苗(组培苗由福建省农科院提供,品种为早丰),将手术剪浸入菌液5 s,组培苗剪叶长度为0.3 cm,每株剪3片叶。将接种苗置于30培养箱中培养。

2.1.2 试验结果

连续观察到第15天,接青枯菌强致病力菌株的番茄组培苗全部发病,接混合菌液的番茄组培苗没有一株发病。延续观察一个月,结果不变。试验说明,BS-1007对青枯菌强致病力菌株存在致弱作用,使青枯菌不再引起植株发病。

2.2  利用PCR技术检测致弱作用

2.2.1 材料与方法

1)菌株的制备

将强致病力菌株F1.3-020626及其经生防菌BS-1007处理后的弱致病力菌株用SPA培养基摇床培养,挑取对数期的菌体。

2)菌株DNA的提取

A. 1.5mL青枯菌培养物,于1.5 mL离心管中,在13000 rpm离心2 min

B. 弃去上清液,沉淀用STE 100 μL洗涤,在13000 rpm离心2 min

C. 吸弃上清液,加467 μL TE buffer,混匀后,再加30 μL 10%SDS3 μL蛋白酶K

D. 37 温浴1 h                 

E. 用酚:氯仿:异戊醇抽提一次,放入沸水浴1-2 min,迅速放入冷水中冷却,在13000 rpm离心10 min

F. 吸取上层水相移入另一干净离心管,加等体积酚:氯仿:异戊醇抽提,在13000 rpm离心10 min

G. 吸取上层水相于干净离心管,加入1/10体积3 M醋酸钠,再加入6/10体积异丙醇沉淀。

H. 于室温放置1020 min,在13000 rpm离心15 min

I. 沉淀用70%乙醇洗涤,沉淀吹干后用40 μL TE buffer溶解。

 

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